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慢病毒整合插入位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)容

原載自：www.diomay.cn[技術(shù)資料頻道] 2025-05-30 瀏覽次數(shù)：245

慢病毒背景

慢病毒載體（Lentiviral vectors, LVs）是在人免疫缺陷病毒HIV-1的基礎(chǔ)上改造而來(lái)的，可以將大量的遺傳信息傳遞進(jìn)宿主細(xì)胞，并且整合到細(xì)胞的基因組內(nèi)，使其可以在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)若干代。同時(shí)，由于它的毒力基因已經(jīng)被剔除，作為假病毒可以在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)較為安全的使用。慢病毒載體可以轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞，包含原代細(xì)胞等難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

慢病毒在Car-T細(xì)胞療法中的應(yīng)用

基于慢病毒具有：

感染范圍廣、效率高，有效感染分裂和非分裂的細(xì)胞；

穩(wěn)定性強(qiáng)，整合進(jìn)基因組中，長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)外源的基因；

免疫原性低，安全性相對(duì)較高的特點(diǎn)，慢病毒被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞治療中。

CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-cell，嵌合抗原受體T細(xì)胞）療法是一種突破性免疫療法，通過(guò)基因改造患者的T細(xì)胞，使其表達(dá)特定的CAR（嵌合抗原受體），從而識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞。目前主要用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤（如B細(xì)胞白血病、淋巴瘤），并逐步向?qū)嶓w瘤拓展。

慢病毒整合的特性

慢病毒是目前CAR-T主流轉(zhuǎn)導(dǎo)方式（FDA已批準(zhǔn)的CAR-T產(chǎn)品中，約90%采用LV），慢病毒整合在細(xì)胞內(nèi)是半隨機(jī)整合（偏好轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)）。

慢病毒通過(guò)識(shí)別宿主表面受體，把RNA和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)；

病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄形成線性雙鏈cDNA（含兩端LTR序列）

整合酶識(shí)別LTR,cDNA被整合到宿主基因組中；

外源基因隨宿主細(xì)胞分裂持續(xù)表達(dá)。

整合偏好性：

整合位點(diǎn)分析（Integration Site Analysis, ISA）是基因治療產(chǎn)品（如CAR-T）臨床開(kāi)發(fā)和上市后監(jiān)測(cè)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其法規(guī)要求由各國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)（如FDA、EMA）制定，旨在評(píng)估基因組整合的潛在風(fēng)險(xiǎn)（如插入突變、克隆擴(kuò)增）。

目前檢測(cè)ISA的方法有LM-PCR、NGS、單細(xì)胞測(cè)序等，為了保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，科佰生物開(kāi)發(fā)了一系列慢病毒整合位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品供檢測(cè)機(jī)構(gòu)使用，作為品質(zhì)衡量的標(biāo)尺對(duì)檢測(cè)能力進(jìn)行判別。在前文 慢病毒整合位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品強(qiáng)勢(shì)來(lái)襲一文中，已對(duì)單克隆多插入位點(diǎn)、單克隆單插入位點(diǎn)、性染色體插入位點(diǎn) 做了產(chǎn)品的說(shuō)明及數(shù)據(jù)展示。近期科佰推出了5% 2% 整合頻率的慢病毒多克隆多整合位點(diǎn)參考品，由多個(gè)單克隆整合位點(diǎn)產(chǎn)品混合而來(lái)，覆蓋20個(gè)插入位點(diǎn)，分別來(lái)自11個(gè)不同染色體上的20個(gè)基因，如下表所示

表格管理_Sheet2(1).png

圖片1.png

Figure 1. 基因分布

圖片2.png

Figure 2. 染色體分布

每個(gè)位點(diǎn)經(jīng)過(guò)LM-PCR（用于識(shí)別已知DNA與相鄰未知DNA的一種技術(shù)，可結(jié)合NGS，對(duì)IS進(jìn)行高通量分析）、 NGS（捕獲探針?lè)y(cè)序）技術(shù)檢測(cè)，Sanger測(cè)序驗(yàn)證，以及dPCR檢測(cè)定標(biāo)整合頻率，確保插入位點(diǎn)的準(zhǔn)確定位和整合頻率的精準(zhǔn)測(cè)量。

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